五、光学成像

1. 光学 vs CT/MRI/超声对比

光学成像： 具有高分辨率和分子特异性的优势，但穿透深度浅，主要用于病理、眼科和皮肤科。
CT： 密度分辨率好，适合全身成像，但存在辐射限制。
MRI： 软组织对比度强，常用于脑、脊髓和关节检查，不过成本较高。
超声： 具有实时成像且无辐射的优点，常用于胎儿、腹部和心脏检查，但其分辨率相对有限。

2. 光的基本性质

波粒二象性：光既具有波动性（反射、折射、衍射、干涉、偏振），也具有粒子性（光电效应、能量离散化、康普顿散射）。
能量公式：\(E=h\nu\)。
生物成像常用波段：可见光和近红外波段。
折射：斯涅尔定律 \(\frac{\sin\theta_1}{v_1} = \frac{\sin\theta_2}{v_2}\) (通常写作 \(n_1 \sin\theta_1 = n_2 \sin\theta_2\))。
衍射：\(d \sin\theta = n\lambda\)，光通过小孔时发生扩散。点光源成像后形成艾里斑 (Airy disk)，这是分辨率存在物理极限的根本原因。
横向衍射极限瑞利判据：\(d = \frac{0.61\lambda}{NA}\)。
散射：组织内部折射率不均匀→导致光路不断弯曲→产生散射。

3. 光与生物组织的相互作用

主要作用：反射、折射、散射、吸收、发射、透射。

吸收：遵循比尔-朗伯定律：\(I = I_0 e^{-\mu_a x}\)。
主要吸收体：水、黑色素、血红蛋白 (Hb/HbO2)。
医学应用：脉搏血氧仪、光学监测氧代谢、功能性光学成像（fNIRS）等。
生物分子的电子吸收特性：具有光吸收特性的主要生物分子类别：
①芳香族氨基酸：如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
②核酸碱基及核苷：如腺嘌呤、腺苷。
③辅酶：如 NADH、NAD⁺。
④核酸：如 DNA、RNA。
光吸收测量：分光光度法。
光密度：\(OD = \log_{10}(I_0/I)\)。
透射率：\(T = I/I_0\)。
散射：\(I_s \propto \frac{1}{\lambda^4}\)（蓝光散射最强）。
米氏散射：粒子尺寸接近或大于波长（如细胞核、胶原纤维）。散射强度对波长依赖较弱，且倾向于前向散射。
阴天的云层之所以呈现白色，是因为云层由大量的液态水滴或冰晶组成，这些颗粒的直径与可见光的波长相当或更大，此时光线发生米氏散射，米氏散射的特点是散射强度对光波长的依赖性很小，导致阳光中所有颜色的光（红、绿、蓝等）几乎被等量地散射和反射，混合在一起后便在人眼中呈现出明亮的白色或灰色。
瑞利散射：
晴朗的天空之所以呈现蓝色，是因为大气中存在大量直径远小于可见光波长的微小颗粒（主要是氮气和氧气分子），当阳光穿过大气层时发生瑞利散射，根据瑞利散射定律，散射强度与光波长的四次方成反比，因此波长较短的蓝紫光被散射得最为强烈并弥漫在天空中。

4. 组织光学窗口

①短波长（蓝光）： 吸收强，血红蛋白和黑色素对这个波段的光吸收非常强。散射强，短波长蓝光的瑞利散射强。光在组织表层就被吸收或散射掉了，穿透深度最浅。
②中波长（绿光）： 吸收仍强，穿透深度有限。
③第一光学窗口（650–950 nm）：吸收最低，这是组织成像的黄金波段。此时，血红蛋白和黑色素的吸收已经大幅下降，而水的吸收还没有显著上升。随着波长增加，散射效应减弱。光能够穿透得最深，非常适合深层组织的成像和检测。
④长波长（>950 nm）：水吸收上升，虽然散射进一步减弱，但水对光的吸收急剧上升，穿透深度再次降低。
光学反照光谱原理： 当光照射到组织上时，一部分发生镜面反射，另一部分进入组织内部。进入组织的光会遇到细胞、细胞核等“吸收中心”和散射粒子，发生多次散射。最终有一部分光会“反向”射出组织表面，这被称为漫反射。
技术特点： 信息丰富，通过分析射出的光，可以推断出组织的吸收和散射特性；无创，不需要切开组织；灵活多样，可以在体表、体腔内或通过内窥镜使用。具备定位能力，可以通过光纤探头精确检测特定位置。
漫反射光谱的临床应用： 前列腺活检。
诊断依据：这种组织形态学的改变会直接影响光的弹性散射光谱。癌变组织的漫反射信号通常很强，且信号特征依赖于组织学的分级。
优势是可以在活检针进入组织的瞬间告诉医生这里是不是肿瘤，从而实现“光学引导”的精准活检，而不是盲目穿刺。

5. 光学显微镜

基本组成：

①光源： 白光灯/LED，提供照明。
②聚光镜/聚光系统： 聚焦照明光到样本，控制对比度与照明 NA。
③载物台： 放置样品。
④物镜： 决定分辨率、放大倍率、数值孔径（NA）。
⑤筒镜。
⑥目镜/相机： 图像检测。

关键参数：

放大倍数： 物镜放大倍数 × 目镜放大倍数。
数值孔径： \(NA = n \sin \alpha\)，决定了聚光能力和分辨率，\(\alpha\)为半锥角。
分辨率： 衍射极限。
① Magnification (放大倍率)：60x。
② NA (numerical aperture) (数值孔径): 1.40。数值孔径是衡量物镜聚光能力和分辨率的关键指标。1.40 是一个非常高的数值，通常只有油镜才能达到这么高的 NA。NA 越大，分辨率越高，图像越亮。
③ Immersion medium (浸没介质): Oil/water/air/glycerol，指物镜与样品盖玻片之间需要填充的介质。常见的有油（Oil）、水（Water）、空气（Air）或甘油（Glycerol）。
④ WD (working distance) (工作距离): 0.21 mm, 定义：指物镜前透镜表面到盖玻片顶表面之间的距离。
⑤ Cover glass thickness (盖玻片厚度): 0.17 mm。有些物镜带有 Correction collar（校正环），可以调节以适应不同厚度的盖玻片。
⑥ \(\infty\) Infinity-corrected objective (无限远校正物镜)，表示该物镜的光学系统是无限远校正的。这种设计允许在物镜和镜筒透镜之间的光路中插入滤光片、偏振片等光学元件，而不会造成图像偏移或产生重影。
⑦ Plan, Apo: Plan（平场）：平场校正，意味着镜头经过校正，使得视场边缘和中心一样清晰（消除了场曲）；Apo（复消色差）：复消色差校正。它能校正三种颜色（红、绿、蓝）的色差，使它们汇聚在同一点，确保图像色彩还原最准确，没有由于色差引起的彩边。

对比度机制：

对比度公式：\(C=(I_s-I_b)/I_b\)，对比度决定图像的可读性。
①明场： 这是最基础的显微镜成像方式，其原理是利用光线穿过样品时的吸收率差异来产生对比度。光线直接照射样品，样品中较致密的区域会吸收更多的光而显得较暗，背景则显得较亮，适用于观察本身具有颜色或经染色后对光有明显吸收的样本，但对无色透明的活细胞成像效果较差。
优点：简单、直观、适合染色组织。
缺点：对透明生物样品，对比度非常低。
②相差（Phase Contrast）：其原理是将光通过透明样品时产生的肉眼无法识别的相位差转化为人眼可见的亮度差。当光线穿过折射率不同或厚度不均的细胞结构时会发生相位延迟，相差显微镜通过特殊的光环和相位板，让直射光和发生衍射的光发生干涉，从而使透明的细胞结构呈现出明显的明暗对比，非常适合观察未经染色的活细胞。
③微分干涉(DIC)： 这种技术利用偏振光和棱镜将光束微小地分离成两束，穿过样品后再重新汇聚发生干涉。其原理基于样品内部的光程差（折射率或厚度的变化率），干涉结果会产生一种立体感。
④暗场：暗场显微镜的原理是利用特殊的聚光镜阻挡中央直射光进入物镜，仅允许从侧面照射并被样品散射或折射的光线进入观察视野。因此，在没有样品时视野是全黑的，而存在样品时，样品会因为散射光线而在黑暗背景下呈现出明亮的光点，极大地提高了分辨率，特别适合观察微小的颗粒或细菌鞭毛等细节。
⑤偏振： 其原理是利用偏振片产生偏振光照射样品，并检测样品对偏振光状态的改变。如果样品具有双折射性，它会改变入射光的偏振方向，使光线能够通过检偏镜并显得明亮，从而从背景中突显出来，常用于分析具有有序排列结构的材料。
⑥荧光： 荧光显微镜的原理是利用特定波长的激发光照射样品，使样品中的内源性荧光分子或外源性荧光探针受激跃迁，随后发射出波长更长的荧光。通过滤光片过滤掉激发光，仅保留发射出的荧光信号，这种方法具有极高的特异性和灵敏度，能够精准定位特定的蛋白质或细胞器，是具有高度“化学选择性”的成像方式。
荧光关键光学组件： 激发滤光片、分光镜、发射滤光片。
⑦分子振动光谱： 指基于拉曼散射或红外吸收原理的显微技术，其原理是探测光与分子化学键振动模式之间的相互作用。由于不同的化学键具有独特的振动频率，通过检测散射光或吸收光谱的频率变化，可以获得样品的“化学指纹”，从而在无需标记的情况下实现对样品化学成分的识别和成像。
⑧化学对比例子： 苏木精–伊红染色、革兰氏染色。

6. 激光

原理： 受激辐射光放大。必须使处于高能级的粒子数多于低能级粒子数，实现粒子数反转。
特点： 相干性、单色性、方向性强、高亮度。
三要素： 增益介质、泵浦源、谐振腔。

7. 共聚焦显微镜

原理： 使用激光聚焦成一个衍射极限的光斑照明样品上的一个点。在探测器前放置一个针孔，阻挡焦平面以外的背景光和散射光，只允许焦平面上的光通过。通过扫描镜控制光斑在样品上逐点扫描，重构出图像。
成像优势：
①分辨率 极高（微米级），能看清细胞内部结构。
②光学切片：无需物理切片即可获得样品的横断面图像，排除背景干扰，对比度高。
局限性： 穿透深度有限，无法探测人体深部器官。
应用场景： 细胞生物学研究；皮肤反射式共聚焦显微镜用于活体皮肤光学活检，无创诊断皮肤癌或评估皮肤结构。

8. 内窥镜

原理： 纤芯折射率高于包层。基于光纤的全内反射原理，将光导入体内并导出信号。光被限制在折射率较高的纤芯中传输。
进阶成像模式：
①窄带成像(NBI)：利用特定波长的光增强浅表血管的对比度，有助于早期癌症和异常增生的检测。
②共聚焦激光内窥镜 (CLE)： 将共聚焦技术与内窥镜结合，实现“光学活检”，在体内直接看到细胞级的病理图像，无需切取组织。
③荧光内窥镜： 利用内源性或外源性荧光标记代谢或分子差异，检测肿瘤。
成像优势：
可达性：能深入消化道、呼吸道等空腔器官。
微创/无创：减少患者痛苦，实现实时诊断。
局限性： 分辨率较低。
应用场景： 胃肠道、呼吸系统、泌尿生殖系统检查。

9. 光学相干断层成像 (OCT)

OCT 被称为“光学超声”，填补了共聚焦（高分率、浅）和超声（低分辨率、深）之间的空白。

原理：
①低相干干涉： 类似于超声波测距，但使用的是光波的回声。由于光速太快无法直接计时，OCT 利用迈克尔逊干涉仪测量光的回声。
②宽带光源： 使用低时间相干性的宽带光源，只有当参考臂和样品臂的光程差在极短的相干长度内时，才会发生干涉。
③检测弹道光子，利用散射最少的弹道光子保留相位信息进行成像。
成像优势：
①分辨率，轴向分辨率极高（1-10 μm），由光源的相干长度决定。
②穿透深度， 约 1-3 mm，介于共聚焦和超声之间。相干长度越短，深度分辨率越好。
③断层成像， 通过 A-scan (深度扫描) 组合成 B-scan (截面图) 再重建 3D 图像。
应用场景： 眼科，诊断视网膜疾病（如 AMD、糖尿病视网膜病变、青光眼），因为眼球介质透明，适合光深入穿透。视网膜由多层复杂的神经组织构成。OCT 具备微米级的分辨率，能够清晰区分这些细微的层结构，满足临床对视网膜分层分析的严格要求。亦可用于心血管等其他组织成像。

10. 光声成像（PAI）

光声成像 (Photoacoustic Imaging, PAI) 核心原理：光声效应。光声成像基于光声效应，即光能转化为声波的过程。

①光吸收： 使用短脉冲激光照射生物组织，组织中的内源性吸收体（如血红蛋白）吸收光子能量。
②快速加热： 吸收的光能转化为热能，导致局部温度在纳秒级时间尺度内微小上升。
③热弹性膨胀： 快速的温度上升引起受热区域的体积瞬间膨胀。
④声波产生： 这种瞬间膨胀产生了压力波（即超声波/光声信号），并向外传播。
⑤信号检测：使用超声换能器接收这些信号，通过算法重建出组织内部的光吸收分布图像。
成像优势：
①高光学对比度： 利用不同组织成分对光吸收的差异成像，能够反映组织的化学成分和生理功能。
②超声分辨率： 由于信号是声波，散射比光波弱得多，因此突破了光学扩散极限。光声显微镜（PAM）的横向分辨率可达5μm 。
③深穿透深度： 相比纯光学成像，光声成像穿透更深。光声显微镜可达1-3 mm，光声断层成像（PAT）可达毫米级甚至更深。
应用场景： 血管网络成像；功能成像：通过多波长成像计算血氧饱和度，监测代谢活动；肿瘤检测：基于肿瘤新生血管的高血红蛋白含量进行造影。

11. 光谱学

光谱是电磁波与物质之间的相互作用。主要包括散射（如瑞利散射、拉曼散射）、吸收（如UV-Vis、IR、光声）和发射（如荧光）。
分子振动光谱探测化学键振动频率。振动频率与折合质量 \(\mu\) 与化学键的键力常数 \(k\) 有关，即与化合物组成和结构有关。
分子指纹： 不同的化学键有特定的振动模式（伸缩、弯曲等），对应特定的拉曼位移。
表征手段： 红外光谱（吸收，红外光5-10μm）或拉曼光谱（散射，可见光，近红外光）。

12. 拉曼散射

拉曼光谱探测分子的振动能级，提供分子指纹。

原理： 拉曼散射是非弹性散射。光子与分子发生能量交换，散射光的频率发生变化（拉曼位移），反映分子的振动能量。
斯托克斯（Stokes）散射： 光子失去能量，频率降低。
反斯托克斯（Anti-Stokes）散射： 光子获得能量，频率升高。
传统拉曼的困境： 信号极弱（\(10^7\)个光子中仅1个拉曼光子）、易受荧光干扰、成像速度极慢。
SRS原理： 使用两束超快激光（泵浦光 \(\omega_p\) 和斯托克斯光 \(\omega_s\)）。当两束光的频率差 \(\Omega = \omega_p - \omega_s\) 正好匹配分子的振动频率 \(\omega_{vib}\) 时，产生共振，通过受激发射极大地放大拉曼信号。
CARS原理： \(\omega_{as} = 2\omega_p - \omega_s\)。分子同时吸收一个泵浦光子并发射一个斯托克斯光子。这一过程使分子从基态通过虚能级跃迁到振动激发态，建立起相干的分子振动。处于振动激发态的分子再次吸收第二个泵浦光子，跃迁到一个更高的虚能级。分子从高能虚能级回落到基态，并发射出一个频率更高的新光子，即反斯托克斯光。
优势：
①信号增强：比自发拉曼强多个数量级，克服荧光干扰。
②成像速度快：可实现视频级成像。

【光学部分-习题与思考】

1. 与普通白光光源相比，激光在生物医学成像中的主要优势包括哪些： 高方向性、高单色性、相干性、更高的光子密度

2. 关于生物医学内窥镜成像，下列说法哪一项是正确的？ 内窥镜的核心优势在于能够进入体内，实现微创、实时成像

3. 比较共聚焦显微镜与光声成像在分辨率决定机制上的主要差异：

共聚焦：分辨率由光学衍射极限和NA决定。
PAI：分辨率由超声频率和声学聚焦决定。

4. 简述Raman 光谱中“拉曼位移”的物理意义： 拉曼位移是入射光与散射光之间的频率差，反映分子的振动能级，与化学键的键力常数和折合质量有关，是分子“指纹”的来源。

5. 一个物镜标注为 “60× / 1.40 Oil”。请解释这些参数各自代表什么物理或成像含义：

60×：物镜放大倍率。
1.40：数值孔径（NA），决定分辨率和集光能力。
Oil：需使用浸油，增大折射率以提高 NA。

6. 从医学成像的角度出发，比较并讨论至少两种你在本课程中学到的生物医学光学成像技术（例如：共聚焦显微、OCT、光声成像、拉曼/相干拉曼成像）：

选择比较与讨论共聚焦荧光显微镜与OCT。

首先，从成像对比机制与标记需求来看，共聚焦显微镜与OCT存在本质差异。共聚焦显微镜主要基于荧光对比度成像，这意味着它通常需要依赖外源性荧光染料或基因编码的荧光蛋白来特异性标记目标分子，从而获得极高的化学特异性，能够看清特定的生化成分。相比之下，OCT 是一种完全无标记的成像技术，它利用生物组织内部不同微结构对光的背向散射强度差异（即折射率的不均匀性）来形成图像，类似于“光学的B超”，因此它无需染色即可直接对活体组织进行原位观察。
其次，在空间分辨率方面，共聚焦显微镜具有显著优势。它通过物理针孔滤除焦平面以外的杂散光，能够实现极高的亚微米级分辨率，横向通常小于0.5微米，这使得它足以清晰分辨细胞内部的细微结构，如细胞核、线粒体或细胞骨架。而 OCT 的空间分辨率通常在微米级别，约1-10微米，虽然其分辨率略逊于共聚焦显微镜，难以分辨单个细胞器，但其优势在于轴向分辨率主要由光源的宽带特性（相干长度）决定，与横向聚焦相对独立，足以提供清晰的组织层级结构信息。
最后，针对成像深度及相应的应用场景，两者的适用范围截然不同。共聚焦显微镜受限于可见光在生物组织中的强散射效应，其有效成像深度通常非常浅（<500微米），因此主要应用于基础生物学中的单细胞研究或皮肤表层的病理分析。而 OCT 采用穿透力更强的近红外光，并结合相干门控技术有效剔除散射光子，能实现1-2毫米的成像深度。这种优秀的深层穿透能力使得 OCT 能够穿透视网膜全层，成为眼科疾病诊断的金标准，同时也广泛应用于心血管内窥成像等临床领域。